Czym jest diabetyczna nefropatia i jakie mechanizmy jej leżą u podstaw?
Diabetyczna nefropatia (DN) stanowi powikłanie cukrzycy dotykające około 40% pacjentów z cukrzycą typu 2 i 30% pacjentów z cukrzycą typu 1. Jest ona związana ze zwiększoną chorobowością i śmiertelnością, głównie z powodu zdarzeń mikronaczyniowych. DN jest jedną z głównych przyczyn przewlekłej choroby nerek (CKD), a w zaawansowanych stadiach może prowadzić do schyłkowej niewydolności nerek (ESRD).
Hiperglikemia, będąca pierwotnym objawem cukrzycy, powoduje powikłania poprzez zaburzenie homeostazy metabolicznej i hemodynamicznej. Szacuje się, że od 25% do 40% pacjentów z cukrzycą rozwinie DN po 10-35 latach progresji choroby. DN charakteryzuje się pogrubieniem błony podstawnej kłębuszka (GBM), ekspansją mezangium z lub bez stwardnienia guzkowego, śmiercią podocytów i uszkodzeniem śródbłonka, a następnie zmniejszeniem liczby nefronów. Choroba ta postępuje przez trzy etapy: najpierw przerost kłębuszków nerkowych i hiperfiltracja, następnie stan zapalny i przerost cewkowo-śródmiąższowy lub ekspansja kłębuszków, a w końcu redukcja liczby komórek z powodu apoptozy i akumulacja macierzy mezangialnej w zaawansowanych stadiach.
Z drugiej strony, zmiany metaboliczne i bioprodukty generowane podczas metabolizmu glukozy aktywują różne szlaki sygnalizacyjne, prowadząc do zwiększonej produkcji reaktywnych form tlenu (ROS). Główne aktywowane szlaki obejmują te związane z tworzeniem końcowych produktów zaawansowanej glikacji (AGE), które powodują uszkodzenia komórkowe; szlak poliolowy, w którym glukoza jest przekształcana w sorbitol, powodując stres osmotyczny i oksydacyjny; oraz szlak heksozaminowy, przez który glukoza generuje produkty O-GlcNAcylowane modyfikujące czynniki transkrypcyjne, takie jak białko specyficzności (Sp1), zwiększając ekspresję genów zależnych od Sp1 i promując syntezę zarówno TGF-β, jak i inhibitora aktywatora plazminogenu 1 (PAI-1).
Jak zmiany w komórkach mezangialnych przyczyniają się do progresji choroby?
Komórki mezangialne (MC), które stanowią około 30-40% populacji komórek kłębuszka nerkowego, wykazują ekspresję trzech typów transporterów glukozy: SGLT2 i GLUT-4 (transportery ułatwionej dyfuzji wrażliwe na insulinę), a także GLUT-1, najbardziej obfity i funkcjonalnie istotny transporter. W warunkach hiperglikemicznych wykazano, że nadekspresja GLUT-1 indukuje ekspresję TGF-β1, co promuje produkcję macierzy mezangialnej, a w stanie przewlekłym hamuje jej proliferację.
Ekspansja mezangialna jest konsekwencją trzech ważnych zdarzeń: najpierw proliferacji komórek mezangialnych, następnie nadmiernej produkcji macierzy mezangialnej, a wreszcie przerostu komórek mezangialnych. Początkowo komórki mezangialne ulegają proliferacji jako część odpowiedzi na uszkodzenie nerek, przyczyniając się do początkowego stanu ekspansji mezangialnej. Następnie efekt TGF-β jest powiązany z fenotypową trans-różnicowaniem komórek mezangialnych do fenotypu miofibroblastów, co prowadzi do zwiększonej syntezy białek.
Normalna macierz mezangialna składa się z kolagenów IV i VI, lamininy, fibronektyny, trombospondyny i proteoglikanów siarczanu chondroityny. Aktywacja komórek mezangialnych prowadzi do ekspresji białek, które normalnie nie występują w macierzy mezangialnej i są trudne do wyeliminowania, w tym kolagenów I i III (śródmiąższowych/fibrylarnych); zwłaszcza kolagen I i fibronektyna są głównymi składnikami tkanki zwłókniałej. Dodatkowe czynniki indukujące ekspansję mezangialną obejmują TGF-β, płytkopochodny czynnik wzrostu (PDGF), IL-1β, czynnik martwicy nowotworu α (TNF-α), podstawowy czynnik wzrostu fibroblastów (bFGF), angiotensynę II (ANG II), czynnik wzrostu tkanki łącznej (CTGF), insulinopodobny czynnik wzrostu 1 (IGF-1), eikozanoidy i leptynę.
W końcu przerost komórek mezangialnych charakteryzuje się zmniejszoną proliferacją, nadekspresją α-SMA i zwiększoną morfologią wielokątną. Obecnie trudno jest osiągnąć bezpieczne i skuteczne odpowiedzi na leczenie farmakologiczne CKD, ponieważ stan zapalny nie jest zjawiskiem wtórnym, ale centralnym mechanizmem, który utrwala postęp uszkodzenia nerek nawet po podaniu leków. Utrzymująca się aktywacja cytokin i czynników profibrotycznych utrzymuje szlaki sygnalizacyjne, które nadal napędzają postęp choroby niezależnie od efektu terapeutycznego.
Czy nowoczesne terapie kontrolujące hiperglikemię mogą zahamować progresję DN?
Dlatego leczenie pierwszego rzutu składa się z leków kontrolujących hiperglikemię, wśród których wyróżniają się inhibitory SGLT2 (iSGLT2) i agoniści glukagonopodobnego peptydu-1 (GLP-1). Oba rodzaje leków są stosowane w celu zmniejszenia białkomoczu i nefropatii nadciśnieniowej; jednak te terapie jedynie opóźniają postęp choroby i często wymagają wysokich dawek do osiągnięcia efektów terapeutycznych, co może zwiększyć ryzyko działań niepożądanych.
Ponadto ważne jest podkreślenie doniesień o znaczeniu sygnalizacji β-AR w biogenezie mitochondrialnej i jej rolach w regulacji metabolizmu glukozy, stanu zapalnego i apoptozy w nerkach. W różnych kontekstach patologicznych, takich jak DN, rozważanie sygnalizacji β-AR sugeruje obiecujące kierunki farmakologicznej i molekularnej modulacji szlaków β-adrenergicznych jako strategii terapeutycznej przeciwko chorobom nerek.
Tamsulosyna, sulfonamid i selektywny antagonista receptorów α1A i α1D-AR, jest głównie stosowana w celu złagodzenia objawów związanych z łagodnym rozrostem gruczołu krokowego (BPH). Ponadto jest stosowana w leczeniu kamicy nerkowej, kamieni moczowodowych, zapalenia gruczołu krokowego i różnych zaburzeń układu moczowego. W modelu in vitro DN z komórkami śródbłonka kłębuszków nerkowych wykazano, że tamsulosyna zmniejsza stężenie cytokin prozapalnych, takich jak IL-1β, IL-6, TNF-α i IL-8, a także ekspresję TGF-β1 i kolagenu I.
Z drugiej strony, pioglitazon działa jako uwrażliwiacz na insulinę i pomaga kontrolować hiperinsulinemię. Jest podawany pacjentom z cukrzycą typu 2 jako lek drugiego lub trzeciego rzutu, w monoterapii lub w połączeniu z metforminą lub pochodnymi sulfonylomocznika.
Chociaż niewiele badań koncentrowało się na stosowaniu pioglitazonu jako leku przeciwzwłóknieniowego, stwierdzono, że aktywacja receptorów PPAR-γ zmniejsza proliferację i apoptozę w komórkach mezangialnych aktywowanych ANG II. W badaniu in vivo przeprowadzonym przez Ko i wsp. w 2008 r. stwierdzono, że podawanie pioglitazonu szczurom z cukrzycą typu 2 miało działanie renoprotekcyjne poprzez hamowanie aktywacji NF-κB i zmniejszenie ekspresji TGF-β oraz syntezy kolagenu, co łagodziło DN. Wyniki te są zgodne z wynikami przedstawionymi przez Maeda i wsp. w 2005 r., którzy przeprowadzili podobne badanie in vitro w komórkach mezangialnych aktywowanych TGF-β1.
Ponadto w 2014 roku Wang i wsp. aktywowali komórki mezangialne in vitro w środowisku o wysokim stężeniu glukozy (25 mM), obserwując zwiększony poziom produkcji ROS poprzez ekspresję p22phox i p47phox. Po leczeniu tych komórek pioglitazonem zaobserwowano zmniejszenie ekspresji tych markerów w sposób zależny od dawki, co sugeruje, że może on działać jako modulator stresu oksydacyjnego; jednak jego mechanizm działania pozostaje nieznany.
Oprócz działania przeciwzapalnego, naukowcy zaczęli badać jego efekty przeciwnadciśnieniowe, które pośrednio przyczyniają się do zmniejszenia uszkodzeń nerek ze względu na dużą liczbę receptorów PPAR-γ wyrażanych w mezangium. W rzeczywistości zaobserwowano, że obecność agonistów PPAR-γ daje lepsze wyniki niż zahamowanie aktywności układu renina-angiotensyny przy użyciu inhibitorów konwertazy angiotensyny.
Jak badania in vivo i in vitro wzbogacają naszą wiedzę o DN?
Ostatecznie, w modelu in vivo DM stosowanym w naszym laboratorium, z udziałem szczurów Wistar indukowanych streptozotocyną, zaobserwowano, że tamsulosyna i pioglitazon zmniejszały uszkodzenia spowodowane podwyższonym poziomem glukozy w surowicy, działając jako czynniki renoprotekcyjne i przywracając strukturę morfologiczną. Ponadto nasza grupa badawcza odnotowała poprawę markerów funkcji nerek, w tym stężenia kreatyniny w surowicy, mocznika, BUN i FBG; zmniejszoną ekspresję markerów zapalnych, takich jak NF-κB i IL-1β; zwiększony poziom IL-10; oraz zmniejszenie zwłóknienia wraz z niższą ekspresją TGF-β i kolagenu IV.
Celem niniejszego badania była ocena wpływu tamsulosyny i pioglitazonu na komórki mezangialne (SV40 MES 13) eksponowane na wysokie stężenia glukozy in vitro, w celu ustalenia, czy leki te mają istotny wpływ na odpowiedź oksydacyjną, zapalną i fibrogenną tych komórek, które są kluczowe w rozwoju DN, a w konsekwencji ekspansji mezangialnej obserwowanej w modelu in vivo.
Kluczowe mechanizmy nefropatii cukrzycowej:
- Hiperglikemia prowadzi do zaburzeń metabolicznych i hemodynamicznych w nerkach
- Choroba rozwija się w 3 etapach:
– Przerost kłębuszków i hiperfiltracja
– Stan zapalny i ekspansja mezangialna
– Redukcja liczby komórek i akumulacja macierzy - Główne szlaki uszkodzenia:
– Tworzenie końcowych produktów glikacji (AGE)
– Szlak poliolowy powodujący stres osmotyczny
– Szlak heksozaminowy modyfikujący czynniki transkrypcyjne
Jak badania komórkowe ujawniają efekty tamsulosyny i pioglitazonu?
W badaniu wykazano, że komórki SV40 MES 13 poddane działaniu różnych stężeń glukozy, tamsulosyny i pioglitazonu wykazywały zróżnicowane efekty. Pioglitazon nie wykazywał działania cytotoksycznego w niskich stężeniach. Przy 1 μM żywotność komórek wynosiła 110,12%, przy 10 μM – 109,34%, a przy 100 nM – 106,52%. To ostatnie stężenie wybrano do dalszych eksperymentów. Tamsulosyna również nie wykazywała działania cytotoksycznego, z maksymalną żywotnością obserwowaną przy 50 nM (104,55%). Stężenie to wybrano do dalszych badań.
Dla glukozy najwyższą żywotność obserwowano przy 30 mM (115,25%), podczas gdy przy 20 mM wskaźnik przepuszczalności osiągnął 3,02, czyli około trzykrotnie wyższy niż w grupach kontrolnych, wskazując na uszkodzenia komórkowe porównywalne do tych obserwowanych przy 25 i 30 mM.
Oba leczenia nie wykazały istotnej statystycznie różnicy w porównaniu z grupą kontrolną w zakresie proliferacji i żywotności. W przeciwieństwie do tego, komórki eksponowane na glukozę (20 mM) wykazały znacznie zwiększoną proliferację (4645,78 komórek/mm2) i żywotność (135,22%). Ponadto, przy tamsulosynie i glukozie zarówno żywotność (126,91%) jak i proliferacja (3824,67 komórek/mm2) zostały zmniejszone w porównaniu z grupą glukozy (20 mM). Niemniej jednak w grupie leczonej glukozą z pioglitazonem żywotność komórek zmniejszyła się o 108,46% przy odpowiedniej proliferacji komórek wynoszącej 4189,56 komórek/mm2.
Aby potwierdzić te obserwacje, przeprowadzono test SYTOX Green. Grupa glukozy (20 mM) wykazała większą przepuszczalność błony komórkowej w porównaniu z grupą kontrolną (2,95-krotnie), wskazując na zwiększone uszkodzenie błony. Sama tamsulosyna (1,75-krotnie) lub pioglitazon (0,83-krotnie) nie spowodowały znaczących różnic w przepuszczalności komórkowej w komórkach SV40 MES 13. Gdy tamsulosyna została dodana do komórek eksponowanych na wysokie stężenie glukozy, przepuszczalność komórkowa zmniejszyła się (2,11-krotnie). Ponadto, w grupie glukozy z pioglitazonem zaobserwowano większe zmniejszenie przepuszczalności komórkowej, redukując ją do 1,94-krotności.
W jaki sposób gwałtowne zmiany markerów wpływają na funkcje komórek mezangialnych?
Najpierw przeanalizowano obecność α-AR i β-AR w SV40 MES 13 w warunkach podstawowych, ponieważ ich ekspresja nie była wcześniej zgłaszana. Wykryto ekspresję α1A-AR, α1B-AR, β1-AR, β2-AR i β3-AR za pomocą PCR; następnie oceniono wpływ wysokiego stężenia glukozy i tamsulosyny (50 nM) oraz wysokiego stężenia glukozy i pioglitazonu (100 nM) na ekspresję AR. Ekspozycja na wysokie stężenie glukozy zwiększyła α1-AR (1,76-krotnie) i zmniejszyła β2-AR (0,12-krotnie) w porównaniu z grupą kontrolną. Podczas gdy leczenie tamsulosyną przez 24 godziny znacząco zmniejszyło ekspresję α1A-AR (0,22-krotnie), ekspresja β2-AR została przywrócona (1,20-krotnie). Z drugiej strony, leczenie pioglitazonem jedynie nieznacznie zmniejszyło ekspresję α1-AR (0,73-krotnie), podczas gdy ekspresja β2-AR była podobna do tej w grupie HG, zmniejszając jej ekspresję (0,13-krotnie).
Przeprowadzono test MitoSOX w celu wykrycia stresu oksydacyjnego poprzez identyfikację jonów ponadtlenkowych generowanych w mitochondriach. W grupie HG zaobserwowano znacznie większą ilość ROS: 3,81-krotnie w porównaniu z grupą kontrolną. Jednak po dodaniu tamsulosyny poziom ROS został zredukowany do 2,08-krotności; ponadto, z pioglitazonem zredukował się do 2,00-krotności, co wskazuje na mniejszą ilość jonów ponadtlenkowych w komórkach.
Aby przeanalizować komórkową odpowiedź na ROS, zastosowano immunofluorescencję do wykrycia NRF2. Tamsulosyna i pioglitazon nie wykazały znaczących efektów. Komórki mezangialne eksponowane na wysokie stężenie glukozy wykazały silną odpowiedź antyoksydacyjną w porównaniu z grupą kontrolną, z NRF2 wzrastającym zarówno w ekspresji genu (11,51-krotnie), jak i białka (8,91-krotnie). Jednak dodanie tamsulosyny lub pioglitazonu do komórek traktowanych glukozą przywróciło poziomy NRF2 do wartości porównywalnych z tymi obserwowanymi w grupie kontrolnej.
Test barwnika Fura-2 AM został zastosowany do wykrycia poziomów jonowych wolnego wapnia cytoplazmatycznego. W grupie HG uwalnianie wapnia wzrosło 2,76-krotnie w porównaniu z grupą kontrolną. Po dodaniu tamsulosyny i pioglitazonu uwalnianie wapnia zmniejszyło się odpowiednio do 1,68-krotności i 1,34-krotności w porównaniu z grupą kontrolną; jednak nie znaleziono istotnej różnicy w porównaniu z grupą indukowaną HG.
Efekty działania badanych leków:
- Tamsulosyna:
– Zmniejsza ekspresję receptorów α1-adrenergicznych
– Redukuje stres oksydacyjny i stan zapalny
– Ogranicza ekspansję mezangialną - Pioglitazon:
– Silniejsze działanie przeciwzapalne
– Znacząco redukuje markery włóknienia
– Skuteczniej hamuje aktywację komórek mezangialnych - Oba leki wykazują działanie nefroprotekcyjne poprzez:
– Zmniejszenie proliferacji komórek
– Redukcję stresu oksydacyjnego
– Ograniczenie ekspansji mezangialnej
Jak leki modyfikują odpowiedź zapalną i fibrogenną w DN?
Po przeanalizowaniu wyników stwierdziliśmy, że sama tamsulosyna lub pioglitazon nie wywołały odpowiedzi zapalnej w komórkach mezangialnych. Jednak w grupie leczonej HG ekspresja genu NF-κB i produkcja białka wzrosły odpowiednio 20,78-krotnie i 2,89-krotnie; IL-1β wzrosła 10,75-krotnie; a IL-17 wzrosła 8,20-krotnie w porównaniu z grupą kontrolną na poziomie genetycznym, wskazując, że HG indukuje silny profil zapalny w komórkach mezangialnych SV40 MES 13. Gdy tamsulosyna była łączona z HG, zaobserwowano redukcję ekspresji genu NF-κB (10,55-krotnie), produkcji białka (1,08-krotnie) i ekspresji IL-17 (1,53-krotnie); jednak tamsulosyna nie zmniejszyła ekspresji IL-1β, która zamiast tego wzrosła do 14,60-krotności. Z drugiej strony, gdy pioglitazon i HG były łączone, zaobserwowano, że markery zapalne, takie jak NF-κB, były zmniejszone na poziomie genu i białka (odpowiednio 0,08- i 1,29-krotnie), a także ekspresja genu IL-17 (1,30-krotnie) i IL-1β (0,20-krotnie).
Tamsulosyna lub pioglitazon nie wykazały znaczących efektów fibrogennych w komórkach mezangialnych. Jednak komórki mezangialne eksponowane na HG wykazały silną odpowiedź fibrogenną w porównaniu z grupą kontrolną, ze wzrostem ekspresji genu TGF-β (4,94-krotnie) i Col I (5,04-krotnie). Gdy tamsulosyna została dodana w połączeniu z HG, poziomy ekspresji wszystkich markerów fibrogennych zmniejszyły się, przy czym TGF-β (2,28-krotnie) i Col I (4,67-krotnie) były znacząco zmniejszone w porównaniu z grupą kontrolną. Gdy pioglitazon był łączony z HG, zaobserwowano, że – podobnie jak tamsulosyna – ekspresja genu TGF-β i produkcja białka (0,79- i 1,29-krotnie, odpowiednio) były zmniejszone oprócz ekspresji genu. Ponadto, w przeciwieństwie do tamsulosyny, pioglitazon był w stanie zmniejszyć ekspresję genu Col I (0,35-krotnie).
Polimeryzację cytoszkieletu F-aktyny analizowano za pomocą testu rodamina-falloidyna. Komórki mezangialne w grupie kontrolnej wykazały najwyższą aktywność cytoszkieletową i niską ekspresję genu α-SMA i produkcję białka, podczas gdy grupa HG wykazała najniższą polimeryzację F-aktyny i zwiększoną ekspresję α-SMA (Acta-2, 3,89-krotnie). Co ciekawe, leczenie tamsulosyną i pioglitazonem w grupie HG skutkowało zwiększoną polimeryzacją cytoszkieletu i zmniejszeniem ekspresji α-SMA (Acta-2, 2,39-krotnie z tamsulosyną i 0,12-krotnie z pioglitazonem), sugerując, że oba leczenia zwiększają tworzenie F-aktyny poprzez polimeryzację G-aktyny i zapobiegają możliwemu obrotowi aktyny, przeciwdziałając niektórym uszkodzeniom spowodowanym przez HG.
Innym czynnikiem związanym z przerostem komórek jest zwiększenie rozmiaru obszaru komórkowego. Dlatego zmierzono obszar komórkowy, który ujawnił statystycznie istotną różnicę w komórkach indukowanych HG w porównaniu z grupą kontrolną, ze średnim obszarem 1202,3 μm2. Z drugiej strony, nastąpiło zmniejszenie w komórkach leczonych pioglitazonem lub tamsulosyną, ze średnimi obszarami odpowiednio 888,6 i 746,8 μm2.
W celu pomiaru ekspansji mezangialnej in vivo, przeprowadzono barwienie PAS, aby odróżnić komórki mezangialne i macierz mezangialną w kłębuszku nerkowym zgodnie z dodatnią reakcją PAS. Grupa kontrolna miała średni obszar mezangialny kłębuszka wynoszący 3219,3 μm2, podczas gdy szczury z DN miały średnią 5659,7 μm2, co stanowi wysoce istotną różnicę. Z drugiej strony, szczury leczone pioglitazonem wykazały średni obszar mezangialny kłębuszka wynoszący 4807,8 μm2, podczas gdy te leczone tamsulosyną uzyskały 4324,1 μm2. Dlatego leczenie zmniejszyło obszar mezangialny, redukując ekspansję mezangialną spowodowaną indukowaną hiperglikemią.
Ponadto, przeprowadzono immunofluorescencję w celu wykrycia komórek pozytywnych dla α-SMA, wykazując, że szczury, które rozwinęły DN, miały większą liczbę komórek pozytywnych, ze średnią 17,3 komórki pozytywnej na kłębuszek; w przeciwieństwie do tego, wartość ta zmniejszyła się do 7,2 w grupie leczonej pioglitazonem i 7,1 w grupie tamsulosyny, wskazując, że te leczenia prawdopodobnie zmniejszyły liczbę komórek mezangialnych zróżnicowanych w miofibroblasty.
Jak cukrzyca prowadzi do przewlekłej choroby nerek?
Przewlekła choroba nerek (CKD) jest długoterminowym powikłaniem cukrzycy spowodowanym utrzymującą się hiperglikemią, na którą cierpią pacjenci, z powikłaniami charakteryzującymi się zmianami naczyniowymi i powikłaniami metabolicznymi z powodu zmian w macierzy pozakomórkowej. Ma to wpływ na oczy (siatkówkę), unaczynienie obwodowe (stopa cukrzycowa) i mocno nawodnione narządy. W szczególności indukuje ekspansję mezangialną i akumulację macierzy pozakomórkowej w nerkach, prowadząc do zmian w fizjologii kłębuszków nerkowych.
Środowisko o wysokim stężeniu glukozy (HG) jest szeroko opisywane w eksperymentach in vitro jako model DN, typowo stosowany w stężeniach 20, 25 i 30 mM. Jednak niektóre badania zgłaszały cytotoksyczność przy 30 mM. Stwierdziliśmy, że ekspozycja komórek mezangialnych na te trzy stężenia glukozy zwiększała proliferację i przerost komórek, a także przepuszczalność komórkową; uszkodzenia komórkowe obserwowano w DN. Ponieważ stężenie 20 mM było związane ze zwiększoną proliferacją i przepuszczalnością we wszystkich powtórzeniach, zostało ono użyte w pozostałych analizach. Dodatkowo, przeliczenie 20 mM na mg/dl dało stężenie glukozy 360,31 mg/dl, co jest stężeniem powyżej normy u niekontrolowanego pacjenta z cukrzycą.
Jednym z głównych wyzwań w tym kontekście jest brak wysoce skutecznych terapii, głównie ze względu na złożoność podstawowych mechanizmów zapalnych i fibrogennych w DN. Terapia pierwszego rzutu zazwyczaj obejmuje leki mające na celu kontrolę hiperglikemii, w tym inhibitory SGLT2 i agonisty receptora GLP-1, które są powszechnie stosowane u pacjentów z białkomoczem lub nefropatią nadciśnieniową. Jednak głównie służą one do spowolnienia postępu tych chorób, często wymagając wysokich dawek, aby osiągnąć korzyść terapeutyczną, co z kolei może podnieść ryzyko działań niepożądanych.
Czy regulacja receptorów adrenergicznych otwiera nowe perspektywy terapeutyczne?
Jednym z celów tej pracy była ocena roli regulacji receptorów adrenergicznych (AR) w metabolizmie glukozy w komórkach mezangialnych, w celu uniknięcia ich aktywacji w środowisku o wysokim stężeniu glukozy – scenariuszu obserwowanym u pacjentów z DN. Istnieje kilka doniesień na temat efektów stymulacji α- lub β-AR na komórkach mezangialnych; na przykład stymulacja α1-AR generuje efekt kurczący, zwiększa syntezę macierzy pozakomórkowej i wywołuje odpowiedź prozapalną. Stymulacja β-AR na komórkach mezangialnych – zwłaszcza β2 – reguluje odpowiedź immunologiczną, zwiększa funkcję i biogenezę mitochondriów oraz optymalizuje funkcję łańcucha oddechowego.
W tym badaniu początkowo wykazano, że komórki mezangialne SV40 MES 13 wykazują ekspresję różnych podtypów α- i β-AR, podobnie jak w pierwotnych hodowlach komórek mezangialnych. Stwierdzono, że komórki mezangialne wykazują ekspresję α1-, α2-, β-, β1-, β2- i β3-AR.
Tamsulosyna – antagonista receptorów α1A i α1D-AR – jest powszechnie podawana w leczeniu łagodnego rozrostu gruczołu krokowego. Niemniej jednak istnieje bardzo niewiele badań na temat jej działania renoprotekcyjnego i możliwych korzyści w zakresie kontroli procesów fibrogennych obserwowanych w DN.
W odniesieniu do zachowań α1- i β2-AR w linii komórkowej SV40 MES 13 inkubowanej w środowisku o wysokim stężeniu glukozy zaobserwowano zmianę w ekspresji tych receptorów: ekspresja α1-AR wzrosła, podczas gdy ekspresja β2-AR zmniejszyła się. Jest to podobne do ustaleń Safi i wsp. (2014) oraz Papay i wsp. (2020), którzy donoszą, że β-AR są dotknięte w komórkach śródbłonka, podczas gdy α-AR wykazują zwiększoną ekspresję. Zatem nasze wyniki sugerują, że zwiększona ekspresja α1-AR w komórkach mezangialnych promuje ich aktywację, prowadząc do stanu prozapalnego i profibrogennego. Po dodaniu tamsulosyny α-AR zmniejszył się, podczas gdy β-AR został przywrócony, wskazując na możliwy efekt regulacyjny na aktywację tych komórek. Pioglitazon złagodził indukowany przez HG wzrost α1-AR, ale nie przywrócił ekspresji β2-AR. Sugeruje to, że downregulacja β2-AR jest głównie napędzana przez hiperglikemię i występuje niezależnie od szlaków mediowanych przez PPARγ.
Jak stres oksydacyjny i mechanizmy antyoksydacyjne wpływają na DN?
Regulacja komórkowego procesu antyoksydacyjnego jest kontrolowana przez system Czynnika Jądrowego Erytroidalnego 2 Powiązanego z Czynnikiem 2 (NRF2), który z kolei jest regulowany przez inhibicję białka Keap 1. Główne czynniki oksydacyjne to ROS generowane w mitochondriach, które są produkowane podczas komórkowego procesu oddechowego w warunkach HG.
Przy wysokim wewnątrzkomórkowym stężeniu glukozy aktywowany jest również szlak poliolowy i zmniejsza dostępność NADPH – kofaktora niezbędnego do regeneracji zredukowanego glutationu, który działa jako antyoksydant wewnątrz komórek. Możliwe, że z tego powodu zaobserwowano wzrost systemów antyoksydacyjnych w komórkach mezangialnych, z powodu wzrostu produkcji ROS po ekspozycji na środowisko HG. Ponadto ekspozycja na stres oksydacyjny prowadzi do nadprodukcji cytokin prozapalnych (np. IL-1β), które z kolei wzmacniają stres oksydacyjny i dalej aktywują NF-κB, ustanawiając pozytywną pętlę sprzężenia zwrotnego zapalenia. Aktywacja systemu NRF2/elementów odpowiedzi antyoksydacyjnej (ARE) przerywa ten cykl poprzez indukcję genów antyoksydacyjnych i przeciwzapalnych – w tym oksygenazy hemowej-1 (HO-1) – które łagodzą uszkodzenia oksydacyjne i ograniczają wydzielanie cytokin i chemokin prozapalnych. Z kolei aktywność NF-κB wpływa na szlak Keap1/NRF2/ARE poprzez wiele mechanizmów: Keap1 pośredniczy w ubikwitynacji i degradacji inhibitora kinazy czynnika jądrowego kappa-B (IKKβ), tym samym hamując NF-κB; mediatory zapalne, takie jak cyklooksygenaza 2 (COX-2), reagują z Keap1, aby aktywować NRF2, koordynując transkrypcję genów przy jednoczesnym tłumieniu aktywności NF-κB; a NF-κB konkuruje z NRF2 o koaktywator transkrypcyjny białko wiążące element odpowiedzi cAMP (CBP). Wspólnie te mechanizmy podkreślają wzajemną regulację między NRF2 a NF-κB jako kluczowy modulator zapalenia wywołanego stresem oksydacyjnym.
Zwiększona ekspresja genu i białka NRF2 obserwowana w komórkach mezangialnych może wynikać z ekspozycji na HG. Chociaż NRF2 jest generalnie cytoprotekcyjny, nadmierna aktywacja została powiązana z efektami proapoptotycznymi. W komórkach β trzustki nadekspresja Keap1 – która tłumi NRF2 – przywróciła proliferację i zmniejsza apoptozę. Podobne efekty proapoptotyczne NRF2 zostały zgłoszone w komórkach nerkowych, poprzez interakcje z p53 i szlakami mitochondrialnymi.
Tamsulosyna indukowała zmniejszenie ekspresji ponadtlenku i NRF2, które są markerami utleniania. Zaobserwowano to również w badaniu Sun i wsp. (2021) w komórkach śródbłonka leczonych tamsulosyną. Wyniki te sugerują, że lek ten ma funkcję antyoksydacyjną, zapobiegając aktywności NF-κB i tym samym zmniejszając poziom ROS, co skutkuje zmniejszeniem markerów zapalnych (NF-κB, IL-6 i IL-8) i fibrogennych (TGF-β1 i Col I). W naszym badaniu tamsulosyna zmniejszyła ekspresję NF-κB i TGF-β w komórkach mezangialnych, sugerując, że – podobnie jak w komórkach śródbłonka kłębuszków – tamsulosyna hamuje NF-κB, wywierając tym samym efekt przeciwzapalny i prowadząc do zmniejszenia zwłóknienia. Komórki mezangialne eksponowane na warunki HG i leczone tamsulosyną wykazały zwiększoną ekspresję IL-1β, pomimo redukcji poziomów NF-κB. Ten paradoks może wynikać z niezależnych od NF-κB szlaków, takich jak te obejmujące AP-1 i MAPK. Wyniki te sugerują, że chociaż tamsulosyna tłumi klasyczne mediatory zapalne, takie jak NF-κB i IL-17, ekspresja IL-1β jest utrzymywana poprzez alternatywne mechanizmy transkrypcyjne, które mogą modulować aktywności kurczliwe i proliferacyjne tych komórek indukowanych HG. Ponieważ istnieje niewiele badań, które omawiały związane z tym działania przeciwzapalne i przeciwfibrogenne, należy przeprowadzić więcej badań skoncentrowanych na zaangażowanych szlakach sygnalizacyjnych.
Efekty przeciwzapalne i przeciwfibrogenne pioglitazonu były wcześniej zgłaszane w modelach in vivo. W obecnej pracy zaobserwowano również, że pioglitazon ma działanie przeciwzapalne i przeciwzwłóknieniowe w komórkach mezangialnych; niemniej jednak do tej pory przeprowadzono ograniczone badania na komórkach mezangialnych i wymagane są dalsze badania in vitro, aby zrozumieć zaangażowane szlaki sygnalizacyjne.
Jak zmiany cytoszkieletu i ekspansja mezangialna wpływają na funkcję nerek?
Z drugiej strony, wewnątrzkomórkowy wapń jest związany z licznymi funkcjami komórkowymi. W komórkach mezangialnych jest głównie związany z kurczeniem się komórek; chociaż w warunkach patologicznych wzrost wewnątrzkomórkowego wapnia może prowadzić do apoptozy lub nekrozy, uszkadzając mitochondria lub retikulum endoplazmatyczne. Niemniej jednak niewiele badań zbadało wpływ wysokich wewnątrzkomórkowych stężeń Ca2+ w komórkach mezangialnych indukowanych przez HG. W badaniu opublikowanym przez Saleh i wsp. (2000), autorzy wykazali, że wysokie stężenia glukozy zwiększyły wewnątrzkomórkowe Ca2+, inicjując szlak sygnałowy apoptozy. W przeciwieństwie do tego, oba leczenia zmniejszyły uwalnianie wapnia, sugerując, że te leczenia zmniejszają uszkodzenia komórek z powodu poziomów HG.
Oceniliśmy również zachowanie składników cytoszkieletu. Donoszono, że w liniach fibroblastów F-aktyna zmniejsza się, podczas gdy ekspresja α-SMA wzrasta, gdy są stymulowane TGF-β, prowadząc do ich różnicowania w miofibroblasty; wynika z tego, że w tej pracy nastąpiła możliwa zmiana fenotypowa w rodzaju aktyny znajdującej się w miofibroblastach.
Na podstawie tych ustaleń w fibroblastach zaobserwowaliśmy, że po interakcji ze środowiskiem HG komórki mezangialne wykazały zmniejszoną polimeryzację G-aktyny do F-aktyny, a także zwiększoną ekspresję białka i genu α-SMA, włókien aktynowych, sklerostyny i komórkowych włókien stresu; ponadto, odpowiedź kanałów wapniowych wzrosła w odpowiedzi na środowisko HG, co koreluje z możliwą zmianą fenotypową w cytoszkielecie, ponieważ skutkuje to zwiększoną ekspresją włókien kurczliwych. Wyniki te pokazują, że rozważane komórki były silnie aktywowane przez środowisko HG, potwierdzając wyniki uzyskane wcześniej w odniesieniu do odpowiedzi prozapalnych i profibrogennych obserwowanych w tych komórkach. Aby potwierdzić odkrycia in vitro, przeprowadzono badanie in vivo za pomocą immunofluorescencji w celu wykrycia produkcji α-SMA w komórkach mezangialnych. W rezultacie sugerujemy, że leczenie zmniejszyło transróżnicowanie komórek mezangialnych spowodowane przez HG. Wcześniejsze badania zgłaszały działanie przeciwzwłóknieniowe i przeciwzapalne tamsulosyny w modelach uszkodzeń wątroby i płuc; jednak jej wpływ na komórki mezangialne w warunkach HG nie był wcześniej dokładnie badany. To badanie pokazuje, że tamsulosyna moduluje ekspresję AR, cytokin prozapalnych (IL-1β, IL-17, NF-κB) i markerów zwłóknieniowych (α-SMA, Col-1), sugerując jej potencjalne role w zmniejszaniu stresu indukowanego hiperglikemią.
Co godne uwagi, tamsulosyna nie zmniejszyła znacząco ekspresji Col-1 w komórkach mezangialnych w warunkach HG (HG: 5,04-krotnie; HG i tamsulosyna: 4,67-krotnie), wskazując na minimalny wpływ w porównaniu z grupą HG. Może to odzwierciedlać zdolność komórek mezangialnych do przyjmowania różnych fenotypów w odpowiedzi na bodźce: komórki spoczynkowe, które utrzymują homeostazę kłębuszków nerkowych, aktywowane komórki wyrażające markery zapalne i fibrogenne oraz inaktywowane komórki, które zachowują stan półaktywny z resztkową ekspresją α-SMA i kolagenu, ale już nie napędzają patologii. Tamsulosyna może ułatwiać przesunięcie w kierunku tego inaktywowanego fenotypu w warunkach HG, modulując aktywację mezangialną bez pełnego tłumienia markerów fibrogennych.
Oprócz wyżej wymienionych informacji, organizacja cytoszkieletu, obecność F-aktyny i zwiększenie obszaru komórkowego komórek mezangialnych dostarczają informacji o tym, czy komórka jest przerosła, co powoduje dezorganizację cytoszkieletu (włókna aktynowe), zwiększenie obszaru komórkowego i mniejszą obecność F-aktyny. Dlatego potwierdzono, że glukoza powoduje przerost komórek, co zostało już szeroko zgłoszone; jednak to badanie po raz pierwszy pokazuje, że zarówno tamsulosyna, jak i pioglitazon zmniejszają przerost komórek w komórkach mezangialnych spowodowany ekspozycją na HG.
Wreszcie przeprowadzono badanie in vivo, aby potwierdzić zachowanie mezangium u szczurów z cukrzycą indukowaną streptozotocyną i wpływ obu terapii na ekspansję mezangialną. Używając techniki barwienia PAS, zaobserwowaliśmy zwiększenie obszaru mezangialnego, wskazując na ekspansję mezangialną związaną z wysokimi stężeniami glukozy we krwi. To odkrycie jest zgodne z naszym badaniem in vitro, gdzie komórki mezangialne wykazały wzrost rozmiaru komórek i wydzielanie macierzy mezangialnej w warunkach HG. Co godne uwagi, leczenie pioglitazonem lub tamsulosyną znacząco zmniejszyło obszar mezangialny. Wyniki te sugerują, że oba leki mogą pomóc w łagodzeniu ekspansji mezangialnej indukowanej hiperglikemią. To odkrycie jest zgodne z badaniem przeprowadzonym przez Morones J. i wsp. (2024) w naszym laboratorium, wykazującym, że oba leczenia zwiększyły szacunkowy wskaźnik filtracji kłębuszkowej (eGFR) w modelu in vivo DN. Ponadto zmniejszyły one markery uszkodzeń surowicy, w tym glukozę na czczo (FBG), kreatynię w surowicy, azot mocznikowy we krwi (BUN) i poziomy mocznika, a także markery moczu uszkodzenia nerek, takie jak glukoza, BUN i mocznik, jednocześnie zwiększając kreatynę moczową. Dodatkowo analiza histopatologiczna ujawniła zmniejszenie markerów zapalenia i zwłóknienia, wskazując, że oba leczenia wywierały efekt renoprotekcyjny.
Podsumowując, nasze wyniki wykazują, że zarówno tamsulosyna, jak i pioglitazon łagodzą aktywację komórek mezangialnych indukowaną ekspozycją na HG poprzez łagodzenie stresu oksydacyjnego, proliferacji komórek i przerostu. Należy zauważyć, że pioglitazon wykazał większą skuteczność w porównaniu z tamsulosyną, ponieważ znacząco zmniejszył ekspresję genu i białka kluczowych markerów zapalnych, a także TGF-β, SMA i kolagenu I – krytycznych wskaźników aktywacji komórek mezangialnych. W eksperymentach in vivo oba leczenia skutecznie ograniczyły ekspansję mezangialną i aktywację. Razem te odkrycia sugerują, że tamsulosyna i pioglitazon mogą służyć jako czynniki ochronne przeciwko aktywacji komórek mezangialnych i przebudowie kłębuszków nerkowych.
Podsumowanie
Badanie dotyczy wpływu tamsulosyny i pioglitazonu na komórki mezangialne w kontekście nefropatii cukrzycowej. W warunkach wysokiego stężenia glukozy komórki mezangialne wykazują zwiększoną proliferację, stan zapalny i włóknienie. Tamsulosyna, antagonista receptorów α1-adrenergicznych, oraz pioglitazon, lek przeciwcukrzycowy, wykazały działanie ochronne poprzez zmniejszenie stresu oksydacyjnego, markerów zapalnych i włóknienia. Pioglitazon okazał się skuteczniejszy w redukcji kluczowych markerów aktywacji komórek mezangialnych. Badania in vivo potwierdziły, że oba leki ograniczają ekspansję mezangialną i chronią przed uszkodzeniem nerek. Wyniki wskazują na potencjał terapeutyczny obu leków w hamowaniu postępu nefropatii cukrzycowej poprzez modulację aktywności komórek mezangialnych.
